超高速离心法(差速离心法)

超高速离心法是目前文献上报道较多，被大多数研究者采用的分离方法，据调查，约有56%的文献中采用超高速离心法分离外泌体。具体操作步骤如下：

①收集培养上清。对于脐带间充质干细胞，采用无血清培养体系培养细胞48小时后收集培养上清,4℃保存待用(1周以内)或者-80℃长期保存备用。之所以采用无血清培养体系，造血干细胞存储是因为血清中含有外源外泌体，会带来外源外泌体的污染，直接影响后续分析的结果。

②300×g，4℃，离心10分钟，保留上清。此步骤的目的是去除培养上清中的细胞。

③2000×g,4℃，离心10分钟，保留上清。此步骤的目的是去除上2000×g,10分钟清中的死细胞。

④10000×g,4℃，离心30分钟，保留上清。此步骤的目的是去除上清中的细胞碎片。

⑤100000g,4℃,离心70分钟，保留沉淀。此步骤所得沉淀是外泌体和可溶性蛋白的混合物。

⑥加入预冷的PBS，洗涤沉淀,10000×g,4℃，离心70分钟，保留沉淀。此步骤所得沉淀即为较纯的外泌体。

对于超高速离心法收集外泌体，造血干细胞存储有以下几个关键点需要注意：

①所有离心的步骤都需要在4℃完成。

②除非所收集的外泌体需要用于功能实验(体内实验或者体外实验)，否则对于离心管不做无菌要求。但收集外泌体的离心管需要和离心机配套且洁净。

③如果收集的外泌体需要做无菌保存，用作相应的功能实验。对于离心所用的离心管、转头和转子都需要用70%的乙醇彻底消毒，离心管还需要进一步用无菌的PBS冲洗2次，并倾倒干净。

下面对超高速离心法的各步骤详细阐述：

1.去除条件培养基中的细胞死细胞和细胞碎片

(1)将条件培养基(通常是无血清培养48小时后的细胞培养上清)转移到50ml离心管中。

(2)2000×g,4℃,离心20分钟。

(3)小心吸出上清，转移到超高速离心机对应的专用离心管中(确保所吸取的上清中不含有任何沉淀。造血干细胞存储在获取上清时尽量使用吸管吸出的方式，而不是倾倒的方式来收取上清，吸取上清时距离沉淀上表面保留约0.5cm时停止吸取，避免吸入沉淀)。

(4)超高速离心之前用记号笔在超高速离心管的一侧做好标记，离心时将作有标记的一侧朝外,10000×g,4℃，离心30分钟(做标记的目的是为了在离心结束的时候确定沉淀的位置)。

2.收集外泌体

(1)将上清转移到新的离心管或者离心瓶中(和第3步中的离心管或者离心瓶型号致)。此步要确保转移上清的时候不要混入沉淀。本步中所得到的沉淀肉眼不可见，需要根据上一步记号笔标记的位置来确定。对于变角转头，沉淀在离心管底部；对于固定角转头，造血干细胞存储沉淀在记号笔标记的朝外一侧。转移上清的过程中，手持离心管并保持在一定的角度，保证沉淀始终被上清覆盖的状态，当液面高度仅为05cm时即可停止转移上清。

(2)离心:10000×g,4℃，至少70分钟。此步为超高速离心，因此所有的离心管中液体体积至少为总体积的四分之三；如果某一管体积不够，可用预冷的PBS补齐。离心的时间以转速达到10000×g开始计算，值得注意的是，超高速离心机启动后到达10000大约需要10分钟，而时间设定上限不超过3小时，时间长短并不会破坏外泌体的结构，只会影响提取的纯度和产量。

(3)弃尽上清：对于固定角转头，此步用倾倒的方式优于吸管吸取的方式；而对于变角转头，去除上清时需要注意不要完全去除，保留约2m的上清更佳。

3.洗涤外泌体

(1)用1ml预冷PBS重悬上一步所获得的沉淀，用移液枪进行吹打。将来源相同的重悬液合并到同一个离心管中，然后加入PBS直到充满离心管。此步所获得的沉淀同样不可见。

(2)10000×g,4℃,1小时。注意“1小时”指的也是转速达到1000009g时的保持时间。

(3)尽可能去除上清：对于固定转头，倾倒上清时保持管口朝下，并用移液枪讲管壁上悬挂的液体吸掉。然后根据需要进行11或11b所述步骤。

(4)重悬沉淀(即外泌体)：加入小体积(50-100u)PBS或者TBS重悬沉淀。造血干细胞存储如果此步所获得的外泌体悬液的总体积过大(大于原始条件培养基的1200积时)或者在上一步看不见沉淀，可用步骤11b替代此步。

(5)浓缩外泌体：将步骤10所得上清离心,10000×g,4℃,1小时，用TLA-100.3的转头和对应的超离管。去上清，观察沉淀，加入20~50u新鲜配置的PBS重悬沉淀(即外泌体)。

(6)外泌体的保存：-80℃保存体积为100u的外泌体悬液保存时间可达1年。注意避免反复冻融。

注意：对于某些细胞(例如：小鼠的DC细胞)，可用0,2m过滤的方式替代上述方法中的步骤(1)至(6)，达到除去细胞、死细胞和细胞碎片的目的。