将 UCMSC置于含有20g/L、碱性成纤维细胞生长因子10g/L、制瘤素20g/L和10%胎牛血清的 DMEM/F12培养基中诱导培养18天,在诱导培养过程中动态观察细胞形态学基因表达、细胞表型、功能等指标的变化。结果发现,诱导培养12~14天,细胞形态变为多边形、椭圆形或圆形,可见到少量悬浮的圆形细胞,16~18天时呈多边形和类原型上皮细胞样细胞。采用免疫组化染色和酶联免疫(ELSA)分析发现,甲胎蛋白表达水平在诱导第7天时达到高峰,之后逐渐下降,18天后消失。采用免疫组化染色发现,角蛋白18、白蛋白在诱导培养后14天呈阳性,18天时呈强阳性。采用PAS法染色发现,诱导8天后的细胞PAS阳性染色物呈红色颗粒或弥散状分布于胞质内。结果表明:① PUCMSC诱导分化为形态特征、表型标志符合肝细胞特点的肝样细胞;西安新生儿干细胞库②诱导获得的肝样细胞具有分泌白蛋白和合成糖原的功能:③体外诱导过程模拟了体内干细胞向肝细胞分化的渐进过程,表现为甲胎蛋白表达逐渐减少,而白蛋白、角蛋白18等功能分子表达逐渐增加。将 UCMSC置于含有肝组织匀浆液100g/L、10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中诱导培养,证实肝组织匀浆液,甚至是来自纤维化的肝组织匀浆液均可诱导 UCMSC分化为肝样细胞,表现为CK18、白蛋白染色阳性,表型标志和形态学变化类似肝脏细胞。与肝细胞共培养法也可诱导 UCMSC定向分化为肝样细胞,呈现肝细胞的表型和功能。
将肝细胞生长因子基因导入 UCMSC后,在体外培养条件下可自动分化为肝样细胞,说明导入基因表达肝细胞因子并诱导了 UCMSC向肝细胞分化。这些证据说明了 UCMSC具备向肝细胞分化的潜能,结果为肝细胞替代治疗、肝脏再生和人工肝等技术发展提供了新的材料来源,西安新生儿干细胞库随着诱导方法的不断改进和完善,在体外大规模诱导培养 UCMSC来源的肝细胞将成为可能,再生肝脏功能和使终末期肝病患者的生存带来新的希望。
除了上述这些诱导 UCMSC定向分化技术外,诱导 UCMSC向生殖细胞、心肌细胞、造血细胞、施万细胞、血管内皮细胞、汗腺细胞、成纤维细胞、皮肤上皮细胞等功能细胞分化的研究也有报道,虽然这些研究只是初步尝试,但充分展示了 UCMSC的巨大分化潜能,为 UCMSC的发育生物研究及定向分化方法及机制探讨开辟了前所未有的新方向。西安新生儿干细胞库关于UCMSC体内外诱导分化的研究至少提示以下问题:① UCMSC具有高度的可塑性,除了难以发育为完整个体或器官以外,似乎可以被诱导分化为3个胚层来源的大部分组织类型的功能细胞,一些尚未报道的分化方向尚待进一步探索;②根据其分化潜能、基因表达谱和免疫表型,在发育阶段上, UCMSC可能是处于胚胎干细胞和成体干细胞之间的一种有别于两种干细胞的新型干细胞;③诱导 UCMSC定向分化的方法多种多样,尚缺乏统一的技术规范和标准,还不能大规模获取诱导后的功能细胞,因此还难以对其进行质量控制、安全性评价,一些疗效评价研究也只限于现象观察,还需要深入研究诱导分化技术及机制,涉及临床应用还需要进行大量临床前研究;西安新生儿干细胞库④ UCSC的可塑性展示了在临床上可用于损伤、退变类疾病治疗的前景,在策略上可定位或系统移植 UCMSC,利用其迁移、归巢和分化特性自己寻找需要修复的组织并发挥作用,也可定向诱导分化为特定的功能细胞后再移植到损伤组织中去参与或促进损伤修复,还可以与生物材料结合培育成组织或器官后再进行移植替代损伤组织。总之,对于 UCMSC可塑性的认识是干细胞研究中的重大技术和理论突破,新的理论认识将引导 UCMSC的研究方向和技术发展,研发出符合临床治疗要求的 UCMSC细胞产品和替代修复材料。
