干细胞的体外培养特性，与一些成熟细胞相比，干细胞的体外培养条件要求相对苛刻，因为它在体外培养条件下容易自然分化而失去干细胞的基本特性。西安白血病干细胞干细胞的体外培养难点是既要维持干细胞的“干性”，又要令其增殖而保持未分化状态，这本身就是一对矛盾。由于不同来源的干细胞，其生长特性差异较大，体外培养条件也有一定差别，一般需要根据不同类型的干细胞建立相应的个性化培养体系，特别是将某种干细胞建成细胞系，更需要建立稳定的培养技术。体外制备干细胞包括干细胞或富含干细胞的材料采集、分离纯化、扩增、鉴定及储存等过程，分离、培养过程需要在无菌层流实验室中进行，需要在培养体系中添加一些维持其“干性”和促进增殖的因子。

胚胎干细胞的体外分离培养原始材料来源包括受精卵发育而来的桑葚胚、囊胚内细胞团、胎儿生殖脊等。体外制备包括以下过程：①原始胚胎干细胞的获取：采用机械法分离、胰酶或胶原酶消化获得原始胚胎干细胞悬液。②细胞传代培养：将细胞悬液接种在改良的 Eargle培养液中培养2~3天，然后转移到经放射线照射或丝裂霉素处理的成纤维细胞饲养层上进行传代培养。由于处理后的成纤维细胞失去了增殖能力，但还能分泌多种细胞因子，可维持胚胎干细胞的“干性”和促进其增殖。饲养层细胞一般采用3T3、STO等小鼠细胞系，也可采用自制的胎鼠成纤维细胞。培养体系中，一般还需要添加适当浓度的胎牛血清(FBS)非必需氨基酸、β-巯基乙醇、白血病抑制因子(LF)干细胞因子(SCF)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等，其中LF具有抑制胚胎干细胞分化的功能。为防止细菌污染可按其他细胞培养体系的要求加入双抗。胚胎干细胞在培养体系中呈克隆生长，待单个细胞长成集落后，挑取细胞集落，用低浓度的胰酶消化分散后，继续用上述培养体系进行传代培养。西安白血病干细胞经反复传代培养，可获得高纯度的生长旺盛的胚胎干细胞。如果撤除培养体系中的血清成分，胚胎干细胞会自动分化形成拟胚胎体，其中含有多种类型的组织细胞，说明血清中可能含有维持胚胎干细胞特性的因子。③细胞鉴定：对细胞的生长特性、表型标志、核型、细胞周期、分化潜能进行分析鉴定。④胚胎细胞储存：将胚胎干细胞置于含有10%二甲基亚砜(MDoS)的胚胎干细胞培养液中，按常规方法程序降温，置于-196℃液氮中长期保存。近些年还开发出一些无血清的干细胞培养基，实验证实干细胞在这些培养基中生长良好，避免了添加血清中携带病原的可能性，减少了胚胎干细胞在体内研究与应用中的干扰因素，为临床应用奠定了基础。基因导入或小分子化合物等诱导培养获得的胚胎干细胞样细胞，其培养、扩增条件与胚胎干细胞相似。优化胚胎干细胞的培养条件，研究更为高效的培养基，特别是不含血清的培养基仍然是胚胎干细胞研究的重要方面。

成体干细胞的种类繁多，几乎在所有组织中均发现有干细胞存在，不同组织来源的干细胞在数量、细胞形态、生长特性、表型标志、分化条件及分化潜能上千差万别，体外培养条件要求不尽一致，很难建立一套适用于所有成体干细胞培养的通用技术方案，需要针对不同类型的成体干细胞建立“个性化”体外制备技术。由于成体干细胞可以来源于自体，避免了免疫排斥和胚胎干细胞涉及的伦理及安全问题，在临床上具有优先应用优势，因此在2000年以来受到高度重视，在体外制备技术方面取得了诸多突破性成果，极大地促进了成体干细胞技术产业的发展和转化应用。成体干细胞体外制备通常也包括材料采集、分离纯化、体外扩增、诱导分化、储存、复苏等关键技术环节。西安白血病干细胞在采集获得成体组织之后，根据组织来源及特性，分别采用机械分离、密度梯度离心、酶消化、免疫磁珠分离、流式细胞术分离等方法分离制备成单细胞悬液，然后将其置于特定的培养体系中进行原代和传代培养，培养体系中一般也要加入维持“干性”和促进其生长的细胞因子，例如干细胞因子(SCF)碱性成

纤维细胞生长因子(bFGF)等。为进一步纯化干细胞，在培养过程中根据干细胞的特性进行贴壁培养、差速贴壁、克隆筛选、免疫吸附等办法进一步纯化和去除杂细胞，例如利用间充质干细胞贴壁生长的特性进行贴壁培养可获得骨髓、脂肪、脐带等组织中的间充质干细胞，采用差速贴壁法可去处其中的少量成纤维细胞。有一些成体干细胞可采用组织块培养法获得，方法是将组织剪碎成小于1mm³大小的组织块，将其接种于培养瓶底，先加入少量培养液，待组织块贴壁后再补充培养液继续培养，其中的干细胞可沿组织块周围长出，然后去除组织块并进行传代扩增获得大量干细胞。这种方法适用于脐带间充质干细胞等贴壁生长较快的干细胞，同一组织块可进行反复培养。骨髓、脐血组织中的造血干细胞一般采用流式细胞术、免疫磁珠法可分离获得纯度大于99%的造血干细胞，但体外扩增相对困难，一般要在半固体培养基上进行扩增，培养基中需要添加血清、多种促进其生长的因子。也有人认为，在干细胞培养体系中添加血小板生长因子可促进干细胞生长，甚至可以取代血清添加。还有一些干细胞在体外培养体系中适于悬浮生长并形成悬浮细胞球，例如海马神经干细胞、视网膜神经干细胞等。西安白血病干细胞总之，成体干细胞的分离主要利用其生长特性进行选择性培养或依据相对特异的标志性细胞表面抗原进行免疫学筛选，体外扩增则需要根据其生长特性建立不同的培养体系和技术方法，培养体系中需要添加促进生长和维持“干性”的细胞因子，否则传代培养后，干细胞会自动分化和老化而失去活性。