西安干细胞关于造血干细胞以外的干细胞研究起步相对晚,但发展极为迅速。早在1962年,Edwards首先发现兔囊胚中的胚胎干细胞( embryonic stem cells,ESC)的分化现象,认为囊胚中的ESC具有多向分化潜能,可自动分化为含有神经、骨、肌肉等多种细胞。由于ESC在体外的生长条件十分苛刻,细胞建系多年均未取得成功。早开展两栖类、鱼类ESC研究的是我国胚胎学创始人童第周,他于1930-1934年在比利时进行蛙受精卵研究中,发现受精卵中已经存在器官形成的物质,并观察到内胚层和外胚层有多能性,吸附乳头和感觉细胞的形成依赖于外源因素,卵质对个体发育起关键作用。随后,童第周的研究小组将鲤鱼的细胞核移植到去核的鲫鱼受精卵内,发现重构的卵可以发育为成体并且具有鲤鱼和鲫鱼的些生物性状,显示细胞质对性状形成有影响,于是他提出了通过核移植把两种不能杂交的鱼的优点结合起来并使之遗传下去的设想。童第周是早提出体细胞核移植理论并在鱼类实验中取得成功的科学家,他是当之无愧的体细胞核移植之父,因为干细胞的许多研究进展得益于童第周的体细胞核移植成功的启示及相关技术的发展。1997年,英国 Roslin研究所的Wilmut利用核移植技术将来自发育成熟的雌性芬兰多塞特白面绵羊的成体乳腺细胞核移植入苏格兰黑面母山羊的去核卵母细胞中,经体外电脉冲使供、受体细胞融合然后将重构的融合细胞移植于另外一只苏格兰黑面母山羊的子宫内,该细胞在子宫内进一步分化和发育,后培育出世界头克隆羊“Doly”。分子生物学分析证明, Dolly的遗传物质来源于雌性芬兰多塞特白面绵羊,其形状与供细胞的白面山羊完全一致。从理论上讲,Doly的遗传物质可能含有少量来自卵母细胞的胞质中的线粒体,但从量上比较微乎其微,并不影响供者的主要遗传特性。Doly.的诞生是生命科学领域里程碑式的重大技术突破,预示着大规模无性繁殖哺乳动物成为可能。之后,全球而掀起了利用体细胞核移植技术克隆动物的热潮,并使其国际竞争白热化。1998年,英国科学家利用体细胞核移植技术获得转基因克隆羊,2000年又获得同源性基因重组后的克隆羊。中国科学家也先后利用体细胞核移植技术获得克隆牛、山羊等,也在利用体细胞核移植技术将人皮肤成纤维细胞移植于兔卵母细胞中制备人源克隆胚胎方面取得成功。到目前为止,克隆牛、羊、鼠、兔、猪、猴等动物均获得成功体细胞核移植技术日趋成熟,越来越多的技术人员利用该技术进行优良品系动物、基因修饰动物、遗传性疾病动物模型培育及发育生物、基因功能研究。利用体细胞核移植技术克隆人类的研究因为存在严重的伦理问题,受到严格限制,但以疾病治疗为目的治疗性克隆在一些国家正在进行。治疗性克隆技术路线与体细胞核移植技术克隆动物一致,只是完成体细胞核移植并在体外培育到囊胚阶段为止,不能将胚胎移植到体内去继续分化和发育成个体。治疗性克隆的目的是从体外重构并在实验室内培育岀的早期胚胎(囊胚)中获得遗传特性与供细胞者一致的胚胎干细胞,然后用于疾病洽疗和相关研究。
哺乳动物的胚胎干细胞体外建系,早于1981年获得成功, Evans和 Kaufman等报道,将已经妊娠2.5天的小鼠卵巢切除,以改变孕鼠的激素水平,从而获得延迟着床的囊胚,体外分离获得内细胞群中的细胞,然后将其饲养于成纤维细胞饲养层上,在培养体系中加入抑制细胞分化的白血病抑制因子( leukemia inhibitory factor,LF),体外传代培养后建成小鼠ESC细胞系。将小鼠的ESC细胞系接种于同源小鼠皮下后可形成多种类型细胞组成的畸胎瘤,表明具有多向分化潜能。1984—-1988年间, Andrews等从睾丸畸胎瘤细胞系Tera-2中培育获得具有多能性的胚胎癌细胞( embronic carcinoma cel),证明胚胎癌细胞在视黄酸的诱导下可分化为神经元样细胞,同时还有一些其他类型的细胞。Pera等于1989年进一步证明,ESC可产生出3个胚层的组织。沿着小鼠ESC体外培养建系的技术路线和方法,美国 Wisconsin大学的 Thomas和 John Hopkins大学的 Gearhart于1998年几乎同时报道,分别从临床上体外受精后培育的囊胚内细胞群和妊娠5~9周的流产胎儿生殖脊中分离获得人类胚胎干细胞和胚胎干细胞样细胞并建立细胞系,这些细胞系表达胚胎干细胞的表型标志性分子,接种于免疫缺陷SCID鼠皮下后可长成包含血管、神经、肌肉、腺体、骨等功能细胞的畸胎瘤,证明人类ESC具有多向分化的潜能。人类ESC建系成功是人类胚胎发育和干细胞研究中的重大技术突破。体细胞核移植和人类ESC建系成功为干细胞技术的快速发展奠定了技术基础,提供了研究模型,创建了干细胞的新来源。之后,以色列、澳大利亚、日本、新加坡、中国等也先后从IVF分离获得人胚胎干细胞系,证明人胚胎干细胞在免疫缺陷鼠皮下可长出包含3个胚层组织的畸胎瘤,西安干细胞并在体外诱导胚胎干细胞生成神经细胞、造血细胞、肌肉细胞、胰岛细胞等。2003年中国科学家陈系古、盛惠珍等人建立了人皮肤成纤维细胞与兔卵细胞融合的方法,为人类胚胎干细胞的研究开辟了新的途径。 Massachusetts Advance Cell7 Technology于2004年报道克隆小鼠的干细胞可通过形成细小血管的心肌细胞修复心衰小鼠的心肌损伤,可以取代40%的癜痕组织和恢复心肌功能。
美国科学家 Thompson实验室的 Gurdon和日本京都大学 Yamanaka实验室于2007年几乎同时报道,利用病毒载体转基因技术将Oc3/4、Sox2、c-Myc和Kif等转录因子基因导入皮肤成纤维细胞,可诱导其转化为几乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞,这种细胞在生长形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸胎瘤生成能力、分化潜能等均与胚胎干细胞极为相似,被命名为诱导性干细胞( induced pluripotent stem cell,iPS细胞)iPS技术的杰出贡献是创建了多能干细胞的新来源,使多能干细胞的获取更容易,方法更简便,可以实现个性化治疗,避免了免疫排斥和获取胚胎干细胞的伦理问题,使胚胎干细胞类细胞的应用向临床推进了一大步。如果说人类胚胎干细胞系的建立是干细胞研究的。
重大里程碑的话,iPS技术就是一个革命性的技术革新, Gurdon和 Yamanaka因此于2012年获诺贝尔生理学或医学奖。中国科学家周琪等于2009年在Nae杂志发表文章,报道了利用iPS细胞囊胚注射获得具有繁殖能力的小鼠,证明iPS细胞具有全能性。我国科学家邓宏魁等于2013年在 Science杂志上报道,利用小分子化合物组合成功诱导体细胞重编程并获得诱导性多能干细胞,证明该诱导细胞可以重新分化为各种组织器官类型的功能细胞,将其命名为化学诱导的多潜能干细胞(CiPS细胞),该研究开辟了一条全新的体细胞重编程途径。CiPS细胞技术不涉及使用病毒载体和引入基因,可以说是多能干细胞研究的又一重大技术突破,使多能干细胞的获取更容易、更安全。
既然可以人为将成熟体细胞的发育时钟拨回“零点”,西安干细胞重新启动发育过程并发育为完整个体,而从早期胚胎获得的干细胞可以在体外被诱导分化为各种类型的成熟细胞,那么,成体组织是否也存在干细胞呢?回答是肯定的。传统认为,只有某些成体组织中存在干细胞,例如骨髓,但它们只能向所在组织或特定类型的成熟细胞分化,难以打破胚层限制,分化为其他类型的成熟细胞。1999年以来,多个研究小组证实,来自成年动物和人的骨髓、肌肉、中枢神经系统、皮肤、肝、肾、肺、脐带血、脐带、脂肪、胎盘等组织中均有干细胞存在,到目前为止,几乎在成体所有组织中找到了干细胞,证明成人体内的干细胞存在于组织中的特定区域,数量十分稀少,处于休眠状态,组织受损时可被激活,开始分裂。骨髓组织中的干细胞含量为丰富,被认为是成体的干细胞库,其中含有造血干细胞、间充质干细胞血管干细胞等,还有人从骨髓组织中分离获得胚胎干细胞样细胞。在正常情况下,骨髓组织中的造血干细胞仅占有核细胞的0.1%~0.5%,其中95%处于G0期,分裂方式为不对称分裂,分化后的数量和特性不变。从理论上讲,骨髓造血干细胞的数量是保持不变的,但可能由于病理因素的影响而减少。骨髓造血干细胞具有异质性,在形态和生物物理特征及表面标志上具有“多态性”和“等级性”。目前认为造血干细胞主要表达CD34抗原,常以CD34、Thy(CD90),低表达或不表达CD38和HLA-DR及缺乏谱系抗原(Lin)为判定标准,一旦分化为各系原、幼细胞后,CD34抗原消失。骨髓间充质干细胞占单核细胞总数的0.001%-0.01%,并随年龄的增加而减少,出生时骨髓间充质干细胞的比例占有核细胞的万分之一,10岁、30岁、50岁、80岁人群的骨髓间充质干细胞的比例分别为1/10万、125万、1/40万、1/200万。 Goode等于1999年发现小鼠肌肉干细胞可以横向分化为血液细胞,这一发现后来被多项实验研究证实,其他组织来源的干细胞也同样具有横向分化功能。对性别错配的肝、肾移植者进行回顾性分析研究发现,移植后的肝、肾组织中有一定数量的受者细胞在组织内分布并分化为肝、肾细胞,推测这类细胞可能是来源于骨髓的干细胞。给全身或局部损伤动物注射干细胞动员剂,骨髓干细胞可进入损伤组织并参与损伤修复。在1999-2000年间,先后有人将来源于骨髓的干细胞移植到脑组织中,发现骨髓干细胞在脑神经组织中转化为神经细胞,同时又将来源于神经组织的干细胞移植到骨髓之中,发现神经干细胞同样可在骨髓中分化、发育成血液细胞。这两个实验结果初步表明,成体组织中的干细胞(组织或成体干细胞)具有跨系、甚至跨胚层分化的能力。后来的一些研究报道证明,成体干细胞的确具有多向分化潜能,可以跨胚层分化为多种类型的功能细胞,西安干细胞到底向什么方向分化,决定于其所处的组织微环境和分化调控因子。西安干细胞已经证实,骨髓干细胞可横向化成为血液、骨、软骨、成骨、肌肉、神经、肝脏、胰腺、脂肪等多种细胞类型。